Son hongos del suelo que se asocian simbióticamente a las raíces para intercambio de nutrientes y aumento del desarrollo radicular de la planta donde se hospedan.
La fabricación y aplicación de hongos micorrícicos requiere técnicas especiales para su monitoreo y control de calidad.
Poner de manifiesto su presencia y cuantificarlos es elemental para determinar el éxito de la colonización micorrícica.
Nos dedicamos preferentemente a dos tipos de micorrizas:
ENDO y ECTOMICORRIZAS.
EN BLANCO
Endomicorrizas: el hongo se distribuye entre las células de las raíces.
Dos tipos son las más importantes: Vesículo-arbusculares y Ericoides.
ENDOMICORRIZAS VESÍCULO ARBUSCULARES
El hongo se distribuye preponderantemente entre las células corticales de las raíces y no es visible a simple vista. La mayoría de las plantas de interés comercial del planeta poseen este tipo de simbiosis: hortalizas, cereales, citrus, etc. En este caso, se lo debe colorear siguiendo procesos microbiológicos específicos.
ENDOMICORRIZAS ERICOIDES
Son similares a las anteriores solo que forman verdaderos «pelotones» por el enrollamiento de las hifas en las células radiculares. Son típicas de cultivos como el arándano, madroño, azaleas o rododendros.
Análisis de endomicorrizas VA y ericoides
CUANTIFICACIÓN DE HONGOS MICORRÍCICOS EN RAÍCES DE PLANTAS
ENSAYO ACREDITADO POR ENAC
En una raíz micorrizada no se puede observar a simple vista la colonización micorrícica. Es necesario realizar procesos de digestión y decoloración de las raíces. Posteriormente se deben teñir para poder resaltar las estructuras fúngicas dentro de las raíces.
El procedimiento finaliza con la observación bajo el microscopio óptico y la identificación del hongo. En la raíz colonizada es factible de distinguir la presencia de arbúsculos (A), vesículas (V) e hifas “runners” (H).
Para la cuantificación de micorriza en raíces hemos adaptado técnicas que permiten precisar de manera exacta y fiable la cantidad de hongo/longitud de raíz observada. Podemos expresar los resultados como Tasa de Micorrización (%).
También se puede calcular la Frecuencia (%) e Intensidad (%) con que aparece el hongo en las raíces teniendo en cuenta durante la observación la presencia de las estructuras y estableciendo un grado de colonización (Trouvelot).
CUANTIFICACIÓN DE ESPORAS Y VESÍCULAS INTRA-RADICALES
DE HONGOS MICORRÍCICOS EN BIOESTIMULANTES.
ENSAYO ACREDITADO POR ENAC
Para el recuento de esporas se debe tener en cuenta los diferentes soportes en que se formulan los inoculantes. Pueden estar en polvo, en partículas de mayor tamaño, en geles, etc.
Utilizamos Método interno basado en UNE-CEN/TS 17722
Los parámetros a determinar son:
Cantidad de esporas
Técnica de tamizado húmedo y decantación, centrifugación en gradiente de sacarosa y conteo bajo microscopio estereoscópico.
Porcentaje de viabilidad de las esporas
Esporas aisladas se incuban con MTT (-(3,4 -dimetiltiazol-2-il)-2,5- difenil tetrazolio), se observa el cambio de coloración de las esporas cuando son viables y se cuantifica.
Número de fragmentos de raíces con vesículas
y Porcentaje de frecuencia de fragmentos de raíces con vesículas intra-radicales.
Después del aislamiento de las esporas, se cuenta los trozos de raíces con vesículas intra-radicales porque son unidades colonizadoras muy eficientes y colaboran en la calidad del bioestimulante y se calcula la frecuencia.
EL RESULTADO FINAL SE EXPRESA COMO UNIDAD POTENCIAL MICORRÍCICA por gramo de Bioestimulante: UPM/g
TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)
Determinación del número de estructuras viables efectivamente colonizadoras
Las esporas cuantificables no siempre son 100 % viables a pesar de que como estructuras de multiplicación y resistencia de los hongos micorrícicos pueden sobrevivir durante largos períodos de tiempo. Hay otras estructuras tales como trozos de raíces micorrizadas, hifas y micelio extramátrico que tienen la capacidad de iniciar la colonización micorrícica. Por esto se ha desarrollado una técnica específica que universalmente se conoce como “Técnica del número Más Probable” para poder expresar cuantitativamente y de manera inequívoca el verdadero potencial colonizador de un inoculante.
El método NMP se basa en realizar una serie de diluciones de la muestra a analizar y utilizar un número de repeticiones de cada dilución. En bandejas de alvéolos se siembra una planta “trampa” micorrizable y una cantidad conocida de cada dilución se dispone en cada alvéolo. Se incuba en cámaras de crecimiento de plantas climatizada con luz, temperatura y humedad reguladas. Al cabo de 60 días se extraen las raíces de las plantas, se tiñen y aplicando una serie de cálculos se puede llegar al resultado: Nº de estructuras viables efectivamente colonizadoras/ g ó cc de inoculante.
Ectomicorrizas: el hongo se aloja en el exterior de la raíz.
CUANTIFICACIÓN DE HONGOS ECTOMICORRÍCICOS EN RAÍCES DE LAS PLANTAS
Tasa de micorrización
El procedimiento es más sencillo que para las endomicorrizas debido a que las ectomicorrizas son visibles incluso a simple vista.
Las raíces de las plantas se lavan cuidadosamente, se cortan en trozos y se mezclan homogéneamente pero en forma aleatoria hasta cubrir una placa cuadriculada específica para estos fines, igual a la usada para cuantificación de endomicorrizas. (Schenck, N.C.1982). Para la cuantificación se sigue el método de intersección de líneas modificado (Giovanetti & Mosse, 1980). Se calcula la longitud de hifas con ápices micorrizados respecto del total de ápices y a partir de allí se establece el porcentaje de raíz micorrizada.
CUANTIFICACIÓN DE ESPORAS DE HONGOS ECTOMICORRÍCICOS EN BIOESTIMULANTES
Se lleva a cabo de manera similar al método de aislamiento y recuento descrito para endomicorrizas.
EN BLANCO
Endomicorrizas: el hongo se distribuye entre las células de las raíces.
Dos tipos son las más importantes: Vesículo-arbusculares y Ericoides.
ENDOMICORRIZAS VESÍCULO ARBUSCULARES
El hongo se distribuye preponderantemente entre las células corticales de las raíces y no es visible a simple vista. La mayoría de las plantas de interés comercial del planeta poseen este tipo de simbiosis: hortalizas, cereales, citrus, etc. En este caso, se lo debe colorear siguiendo procesos microbiológicos específicos.
ENDOMICORRIZAS ERICOIDES
Son similares a las anteriores solo que forman verdaderos «pelotones» por el enrollamiento de las hifas en las células radiculares. Son típicas de cultivos como el arándano, madroño, azaleas o rododendros.
Análisis de endomicorrizas VA y ericoides
CUANTIFICACIÓN DE HONGOS MICORRÍCICOS EN RAÍCES DE PLANTAS
ENSAYO ACREDITADO POR ENAC
En una raíz micorrizada no se puede observar a simple vista la colonización micorrícica. Es necesario realizar procesos de digestión y decoloración de las raíces. Posteriormente se deben teñir para poder resaltar las estructuras fúngicas dentro de las raíces.
El procedimiento finaliza con la observación bajo el microscopio óptico y la identificación del hongo. En la raíz colonizada es factible de distinguir la presencia de arbúsculos (A), vesículas (V) e hifas “runners” (H).
Para la cuantificación de micorriza en raíces hemos adaptado técnicas que permiten precisar de manera exacta y fiable la cantidad de hongo/longitud de raíz observada. Podemos expresar los resultados como Tasa de Micorrización (%).
También se puede calcular la Frecuencia (%) e Intensidad (%) con que aparece el hongo en las raíces teniendo en cuenta durante la observación la presencia de las estructuras y estableciendo un grado de colonización (Trouvelot).
CUANTIFICACIÓN DE ESPORAS Y VESÍCULAS INTRA-RADICALES DE HONGOS MICORRÍCICOS EN BIOESTIMULANTES.
ENSAYO ACREDITADO POR ENAC
Para el recuento de esporas se debe tener en cuenta los diferentes soportes en que se formulan los inoculantes. Pueden estar en polvo, en partículas de mayor tamaño, en geles, etc.
Utilizamos Método interno basado en UNE-CEN/TS 17722
Los parámetros a determinar son:
Cantidad de esporas
Técnica de tamizado húmedo y decantación, centrifugación en gradiente de sacarosa y conteo bajo microscopio estereoscópico.
Porcentaje de viabilidad de las esporas
Esporas aisladas se incuban con MTT (-(3,4 -dimetiltiazol-2-il)-2,5- difenil tetrazolio), se observa el cambio de coloración de las esporas cuando son viables y se cuantifica.
Número de fragmentos de raíces con vesículas y Porcentaje de frecuencia de fragmentos de raíces con vesículas intra-radicales.
Después del aislamiento de las esporas, se cuenta los trozos de raíces con vesículas intra-radicales porque son unidades colonizadoras muy eficientes y colaboran en la calidad del bioestimulante y se calcula la frecuencia.
TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)
Determinación del número de estructuras viables efectivamente colonizadoras
Las esporas cuantificables no siempre son 100 % viables a pesar de que como estructuras de multiplicación y resistencia de los hongos micorrícicos pueden sobrevivir durante largos períodos de tiempo. Hay otras estructuras tales como trozos de raíces micorrizadas, hifas y micelio extramátrico que tienen la capacidad de iniciar la colonización micorrícica. Por esto se ha desarrollado una técnica específica que universalmente se conoce como “Técnica del número Más Probable” para poder expresar cuantitativamente y de manera inequívoca el verdadero potencial colonizador de un inoculante.
El método NMP se basa en realizar una serie de diluciones de la muestra a analizar y utilizar un número de repeticiones de cada dilución. En bandejas de alvéolos se siembra una planta “trampa” micorrizable y una cantidad conocida de cada dilución se dispone en cada alvéolo. Se incuba en cámaras de crecimiento de plantas climatizada con luz, temperatura y humedad reguladas. Al cabo de 60 días se extraen las raíces de las plantas, se tiñen y aplicando una serie de cálculos se puede llegar al resultado: Nº de estructuras viables efectivamente colonizadoras/ g ó cc de inoculante.
Ectomicorrizas: el hongo se aloja en el exterior de la raíz.
Tasa de micorrización
El procedimiento es más sencillo que para las endomicorrizas debido a que las ectomicorrizas son visibles incluso a simple vista.
Las raíces de las plantas se lavan cuidadosamente, se cortan en trozos y se mezclan homogéneamente pero en forma aleatoria hasta cubrir una placa cuadriculada específica para estos fines, igual a la usada para cuantificación de endomicorrizas. (Schenck, N.C.1982). Para la cuantificación se sigue el método de intersección de líneas modificado (Giovanetti & Mosse, 1980). Se calcula la longitud de hifas con ápices micorrizados respecto del total de ápices y a partir de allí se establece el porcentaje de raíz micorrizada.
Cuantificación de esporas de hongos ectomicorrícicos en Bioestimulantes
Se lleva a cabo de manera similar al método de aislamiento y recuento descrito para endomicorrizas.
